Los científicos del Instituto McGovern para Brain Research en MIT y el Broad Institute of MIT y Harvard han rediseñado una enzima compacta guiada por ARN que encontraron en las bacterias en un editor eficiente y programable de ADN humano.
La proteína que crearon, llamada NovaISCB, se puede adaptar para hacer cambios precisos en el código genético, modular la actividad de genes específicos o llevar a cabo otras tareas de edición. Debido a que su pequeño tamaño simplifica la entrega a las células, los desarrolladores de NovaISCB dicen que es un candidato prometedor para desarrollar terapias génicas para tratar o prevenir enfermedades.
El estudio fue dirigido por Feng Zhang, profesor de neurociencia de James y Patricia Poitras en el MIT, que también es investigador en el Instituto McGovern y el Instituto Médico Howard Hughes, y miembro central del Broad Institute. Zhang y su equipo informaron su trabajo de acceso abierto este mes en la revista Biotecnología de la naturaleza.
NovaISCB se deriva de un cortador de ADN bacteriano que pertenece a una familia de proteínas llamada ISCBS, que el laboratorio de Zhang descubrió en 2021. Los ISCBS son un tipo de sistema omega, los antepasados evolutivos de Cas9, que es parte del sistema de CRISPR bacteriano que Zhang y otros se han desarrollado en herramientas de edición de genoma potentes. Al igual que Cas9, las enzimas ISCB cortan el ADN en los sitios especificados por una guía de ARN. Al reprogramar esa guía, los investigadores pueden redirigir las enzimas para dirigir las secuencias de su elección.
ISCBS había llamado la atención del equipo no solo porque comparten características clave de la CAS9 de corte de ADN de CRISPR, sino también porque son un tercio de su tamaño. Esa sería una ventaja para posibles terapias genéticas: las herramientas compacta son más fáciles de administrar a las células, y con una pequeña enzima, los investigadores tendrían más flexibilidad para jugar, potencialmente agregar nuevas funcionalidades sin crear herramientas que fueran demasiado voluminosas para el uso clínico.
De sus estudios iniciales de ISCB, los investigadores del laboratorio de Zhang sabían que algunos miembros de la familia podrían reducir los objetivos de ADN en las células humanas. Sin embargo, ninguna de las proteínas bacterianas funcionó lo suficientemente bien como para ser desplegadas terapéuticamente: el equipo tendría que modificar un ISCB para garantizar que pueda editar objetivos en células humanas de manera eficiente sin alterar el resto del genoma.
Para comenzar ese proceso de ingeniería, Soumya Kannan, una estudiante graduada en el laboratorio de Zhang que ahora es miembro junior en la Sociedad de Fellows de Harvard, y el postdocs Shiyou Zhu primero buscó un ISCB que sería un buen punto de partida. Probaron casi 400 enzimas ISCB diferentes que se pueden encontrar en las bacterias. Diez eran capaces de editar ADN en células humanas.
Incluso el más activo de ellos necesitaría mejorarse para que sea una herramienta de edición de genoma útil. El desafío sería aumentar la actividad de la enzima, pero solo en las secuencias especificadas por su guía de ARN. Si la enzima se volviera más activa, pero indiscriminadamente, cortaría el ADN en lugares no deseados. «La clave es equilibrar la mejora de la actividad y la especificidad al mismo tiempo», explica Zhu.
Zhu señala que los ISCB bacterianos están dirigidos a sus secuencias objetivo mediante guías de ARN relativamente cortas, lo que dificulta restringir la actividad de la enzima a una parte específica del genoma. Si se pudiera diseñar un ISCB para acomodar una guía más larga, es menos probable que actúe sobre secuencias más allá de su objetivo previsto.
Para optimizar el ISCB para la edición del genoma humano, el equipo aprovechó la información de que el estudiante graduado Han Altae-Tran, quien ahora es un postdoc en la Universidad de Washington, había aprendido sobre la diversidad de los ISCB bacterianos y cómo evolucionaron. Por ejemplo, los investigadores notaron que los ISCB que funcionaban en células humanas incluían un segmento que llamaron Rec, que estaba ausente en otros ISCB. Sospecharon que la enzima podría necesitar ese segmento para interactuar con el ADN en las células humanas. Cuando observaron más de cerca la región, el modelado estructural sugirió que al expandir ligeramente la parte de la proteína, REC también podría permitir a ISCBS reconocer guías de ARN más largas.
Según estas observaciones, el equipo experimentó con el intercambio en partes de los dominios REC de diferentes ISCB y CAS9, evaluando cómo cada cambio afectó la función de la proteína. Guiado por su comprensión de cómo ISCBS y CAS9 interactúan con el ADN y sus guías de ARN, los investigadores hicieron cambios adicionales, con el objetivo de optimizar la eficiencia y la especificidad.
Al final, generaron una proteína que llamaron NovaISCB, que era más de 100 veces más activa en las células humanas que en el ISCB con el que habían comenzado, y eso había demostrado una buena especificidad para sus objetivos.
Kannan y Zhu construyeron y proyectaron cientos de nuevos ISCB antes de llegar a NovaISCB, y cada cambio que hicieron a la proteína original fue estratégica. Sus esfuerzos fueron guiados por el conocimiento de su equipo sobre la evolución natural de ISCBS, así como las predicciones de cómo cada alteración afectaría la estructura de la proteína, hecha de usar una herramienta de inteligencia artificial llamada Alfafold2. En comparación con los métodos tradicionales para introducir cambios aleatorios en una proteína y la detección de sus efectos, este enfoque de ingeniería racional aceleró en gran medida la capacidad del equipo para identificar una proteína con las características que estaban buscando.
El equipo demostró que NovaISCB es un buen andamio para una variedad de herramientas de edición del genoma. «Funciona bioquímicamente de manera muy similar a CAS9, y eso facilita el paso sobre herramientas que ya estaban optimizadas con el andamio de Cas9», dice Kannan. Con diferentes modificaciones, los investigadores utilizaron NovaISCB para reemplazar letras específicas del código de ADN en células humanas y cambiar la actividad de los genes dirigidos.
Es importante destacar que las herramientas basadas en NovaISCB son lo suficientemente compactas como para ser fácilmente empaquetadas dentro de un solo virus adeno-asociado (AAV), el vector más comúnmente utilizado para administrar la terapia génica de manera segura a los pacientes. Debido a que son más voluminosos, las herramientas desarrolladas con CAS9 pueden requerir una estrategia de entrega más complicada.
Demostrando el potencial de NovaISCB para su uso terapéutico, el equipo de Zhang creó una herramienta llamada Omegaoff que agrega marcadores químicos al ADN para reducir la actividad de genes específicos. Programaron Omegaoff para reprimir un gen involucrado en la regulación del colesterol, luego usaron AAV para administrar el sistema a los hígados de ratones, lo que lleva a reducciones duraderas en los niveles de colesterol en la sangre de los animales.
El equipo espera que NovaISCB pueda usarse para dirigir las herramientas de edición del genoma a la mayoría de los genes humanos, y espera ver cómo otros laboratorios implementan la nueva tecnología. También esperan que otros adopten su enfoque guiado por evolución para la ingeniería racional de proteínas. «La naturaleza tiene tal diversidad, y sus sistemas tienen diferentes ventajas y desventajas», dice Zhu. «Al aprender sobre esa diversidad natural, podemos hacer que los sistemas estemos tratando de diseñar mejor y mejor».
Este estudio fue financiado, en parte, por el Centro K. Lisa Yang y Hock E. Tan para la Terapéutica Molecular en el MIT, los donantes de regalos de Broad Institute Programmable Therapeutics, Pershing Square Foundation, William Ackman, Neri Oxman, la familia Phillips y J. y P. Poitras.
